Korištenje i mjere opreza ultrafiltracijske centrifugalne cijevi
1) Odaberite odgovarajuću cijev za ultrafiltraciju.Imajte na umu da se UF membrane razlikuju po razini tolerancije na različite kemikalije.Tipično, epruvete za ultrafiltraciju s graničnom vrijednosti molekularne težine od 10 kDa mogu se odabrati s graničnom vrijednosti molekularne težine koja ne smije biti veća od 1/3 molekularne težine proteina od interesa, kao što je 35 kDa.Ako je molekularna težina proteina od interesa oko 10 kD, može se koristiti ultrafiltracijska cijev s graničnom molekularnom težinom od 3 KD.
(2) Ultrafiltracija, svježe kupljena, je suha, s ultračistom vodom dodanom prije upotrebe i vodom koja je potpuno propuštena kroz membranu, ledenu kupelj ili hladnjak prethodno ohlađena nekoliko minuta.Zatim se odlije voda tj. proteinska tekućina i koliko se doda, ono što nije više od bijele crte na vrhu cijevi.Operacija je lagana, a cijev za ultrafiltraciju treba prethodno ohladiti na ledu prije dodavanja otopine proteina.
3) I masa i težište su trebali doći do ravnoteže.Imajte na umu da brzina rotacije i ubrzanje nisu jako veliki, inače izravno oštećuju ultrafiltracijsku membranu.Započeta je centrifugalna ultrafiltracija (centrifuga prethodno ohlađena na 4 stupnja).Nakon što je RPM različitih centrifuga pretvoren u g, bio je drugačiji.Ubrzanje centrifuge je podešeno na minimum, smanjujući pritisak na membranu.Napomena, svakako napustite centrifugu nakon što centrifuga postigne odredišnu brzinu ili ako imate problem, ne možete ga riješiti prvi put.Orijentacija membrane prema vretenu je podešena prema uputama (kutno kućište centrifuge je membrana okomita na os).U praktičnoj uporabi, opća brzina rotacije manja je od one u uputama, tako da se može produljiti vijek trajanja cijevi centrifuge.
3) I masa i težište su trebali doći do ravnoteže.Imajte na umu da brzina rotacije i ubrzanje nisu jako veliki, inače izravno oštećuju ultrafiltracijsku membranu.Započeta je centrifugalna ultrafiltracija (centrifuga prethodno ohlađena na 4 stupnja).Nakon što je RPM različitih centrifuga pretvoren u g, bio je drugačiji.Ubrzanje centrifuge je podešeno na minimum, smanjujući pritisak na membranu.Napomena, svakako napustite centrifugu nakon što centrifuga postigne odredišnu brzinu ili ako imate problem, ne možete ga riješiti prvi put.Orijentacija membrane prema vretenu je podešena prema uputama (kutno kućište centrifuge je membrana okomita na os).U praktičnoj uporabi, opća brzina rotacije manja je od one u uputama, tako da se može produljiti vijek trajanja cijevi centrifuge.
(4) Kada se koncentrira na preostalih 1 ml, uzmite 50 ul otopine pufera, dodajte 10 ul protoka i pogledajte ima li plave boje, kao procjenu nedostaje li u cijevi za ultrafiltraciju proteina.Ako cijev propušta, ponovno izlijte gornji sloj i provucite u novu epruvetu kako biste započeli ultrafiltraciju.Kako biste točno odredili jesu li epruvete propuštene, centrifugirajte 10 minuta s 5 mgml BSA prije protoka, na proteinskom ljepilu ili Bradfordovom sirovom testu i nastavite dodavanjem preostale koncentrirane otopine proteina (koja djeluje na ledu i sprječava zagrijavanje proteina) dok se dodan je sav koncentrat.Budite oprezni tijekom centrifugiranja ako dođe do taloženja proteina, što može dovesti do zatvaranja epruvete.Ako dođe do taloženja, utvrdite je li specifični uzrok taloženja prekomjerna koncentracija proteina ili neodgovarajući pufer;Prvi se može riješiti ultrafiltracijom više ultrafiltracijskih epruveta istovremeno, smanjujući koncentraciju, a drugi izmjenom različitih puferskih otopina dok ne prestane taloženje proteina.
(4) Kada se koncentrira na preostalih 1 ml, uzmite 50 ul otopine pufera, dodajte 10 ul protoka i pogledajte ima li plave boje, kao procjenu nedostaje li u cijevi za ultrafiltraciju proteina.Ako cijev propušta, ponovno izlijte gornji sloj i provucite u novu epruvetu kako biste započeli ultrafiltraciju.Kako biste točno odredili jesu li epruvete propuštene, centrifugirajte 10 minuta s 5 mgml BSA prije protoka, na proteinskom ljepilu ili Bradfordovom sirovom testu i nastavite dodavanjem preostale koncentrirane otopine proteina (koja djeluje na ledu i sprječava zagrijavanje proteina) dok se dodan je sav koncentrat.Budite oprezni tijekom centrifugiranja ako dođe do taloženja proteina, što može dovesti do zatvaranja epruvete.Ako dođe do taloženja, utvrdite je li specifični uzrok taloženja prekomjerna koncentracija proteina ili neodgovarajući pufer;Prvi se može riješiti ultrafiltracijom više ultrafiltracijskih epruveta istovremeno, smanjujući koncentraciju, a drugi izmjenom različitih puferskih otopina dok ne prestane taloženje proteina.
(5) Prvih nekoliko koraka koristi se za koncentriranje proteina, a ako se pufer treba promijeniti, lagano dodajte novi pufer (ultrafiltracijom kroz ultrafiltracijsku membranu od 0,22 um) u oko 1 ml ukupnog proteina i ponovno koncentrirajte na oko 1 ml tijekom tri uzastopnih puta, s konačnim koncentriranim konačnim volumenom ovisno o željenoj koncentraciji proteina, općenito ne više od 500 ul, ali također unutar 200 ul.Postignite 1000 × ili više u tri navrata, u suštini onoliko promjene međuspremnika, koliko je izračunato najmanje 10 × ili više volumenskog obogaćivanja svaki put.
(5) Prvih nekoliko koraka koristi se za koncentriranje proteina, a ako se pufer treba promijeniti, lagano dodajte novi pufer (ultrafiltracijom kroz ultrafiltracijsku membranu od 0,22 um) u oko 1 ml ukupnog proteina i ponovno koncentrirajte na oko 1 ml tijekom tri uzastopnih puta, s konačnim koncentriranim konačnim volumenom ovisno o željenoj koncentraciji proteina, općenito ne više od 500 ul, ali također unutar 200 ul.Postignite 1000 × ili više u tri navrata, u suštini onoliko promjene međuspremnika, koliko je izračunato najmanje 10 × ili više volumenskog obogaćivanja svaki put.
Vrijeme objave: 9. studenog 2022