PCR, je lančana reakcija polimeraze, koja se odnosi na dodavanje dNTP-a, Mg2+, faktora elongacije i faktora pojačanja amplifikacije u sustav pod katalizom DNA polimeraze, korištenjem roditeljske DNA kao predloška i specifičnih početnica kao početne točke produljenja, Kroz korake denaturacije, žarenja, ekstenzije, itd., proces in vitro replikacije lanca kćeri DNK komplementaran matičnoj DNK šablone može brzo i specifično pojačati bilo koju ciljanu DNK in vitro.
1. Hot Start PCR
Vrijeme početka amplifikacije u konvencionalnom PCR-u je da se PCR stroj ne stavi u PCR stroj, a zatim program počinje s amplificiranjem.Kada je konfiguracija sustava dovršena, počinje pojačavanje, što može uzrokovati nespecifično pojačanje, a PCR s vrućim startom može riješiti ovaj problem.
Što je PCR s vrućim startom?Nakon što je reakcijski sustav pripremljen, enzimski modifikator se oslobađa na visokoj temperaturi (obično višoj od 90°C) tijekom početne faze zagrijavanja reakcije ili faze "vrućeg starta", tako da se DNA polimeraza aktivira.Točno vrijeme aktivacije i temperatura ovise o prirodi DNA polimeraze i modifikatoru vrućeg starta.Ova metoda uglavnom koristi modifikatore kao što su antitijela, afinitetni ligandi ili kemijski modifikatori za inhibiciju aktivnosti DNA polimeraze.Budući da je aktivnost DNA polimeraze inhibirana na sobnoj temperaturi, tehnologija vrućeg pokretanja pruža veliku pogodnost za pripremu višestrukih PCR reakcijskih sustava na sobnoj temperaturi bez žrtvovanja specifičnosti PCR reakcija.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) je eksperimentalna tehnika za obrnutu transkripciju iz mRNA u cDNA i njezinu upotrebu kao predložak za amplificiranje.Eksperimentalni postupak je prvo ekstrahirati ukupnu RNK u tkivima ili stanicama, koristiti Oligo (dT) kao početnicu, koristiti reverznu transkriptazu za sintetiziranje cDNA, a zatim koristiti cDNA kao predložak za PCR umnožavanje za dobivanje ciljnog gena ili otkrivanje ekspresije gena.
3. Fluorescentna kvantitativna PCR
Fluorescentni kvantitativni PCR (kvantitativni PCR u stvarnom vremenu,RT-qPCR) odnosi se na metodu dodavanja fluorescentnih skupina u PCR reakcijski sustav, korištenje akumulacije fluorescentnih signala za praćenje cjelokupnog PCR procesa u stvarnom vremenu, i konačno korištenje standardne krivulje za kvantitativnu analizu predloška.Često korištene qPCR metode uključuju SYBR Green I i TaqMan.
4. Ugniježđeni PCR
Ugniježđeni PCR odnosi se na upotrebu dva seta PCR početnica za dvije runde PCR amplifikacije, a produkt amplifikacije druge runde je fragment ciljnog gena.
Ako nepodudarnost prvog para početnica (vanjski primeri) uzrokuje umnožavanje nespecifičnog produkta, mogućnost da drugi par početnica prepozna istu nespecifičnu regiju i nastavi umnožavanje vrlo je mala, tako da amplifikacije drugim parom početnica, poboljšana je specifičnost PCR-a.Jedna od prednosti izvođenja dvije runde PCR-a je ta što pomaže pojačati dovoljnu količinu proizvoda iz ograničene početne DNK.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR je metoda za poboljšanje specifičnosti PCR reakcije podešavanjem parametara PCR ciklusa.
U touchdown PCR-u, temperatura žarenja za prvih nekoliko ciklusa postavljena je nekoliko stupnjeva iznad maksimalne temperature žarenja (Tm) početnica.Viša temperatura žarenja može učinkovito smanjiti nespecifično pojačanje, ali će u isto vrijeme viša temperatura žarenja pogoršati odvajanje početnica i ciljnih sekvenci, što će rezultirati smanjenim prinosom PCR-a.Stoga je u prvih nekoliko ciklusa temperatura žarenja obično postavljena na smanjenje za 1°C po ciklusu kako bi se povećao sadržaj ciljnog gena u sustavu.Kada se temperatura žarenja spusti na optimalnu temperaturu, temperatura žarenja se održava za preostale cikluse.
6. Izravni PCR
Izravni PCR odnosi se na umnožavanje ciljne DNA izravno iz uzorka bez potrebe za izolacijom i pročišćavanjem nukleinske kiseline.
Postoje dvije vrste izravnog PCR-a:
izravna metoda: uzmite malu količinu uzorka i dodajte ga izravno u PCR Master Mix za PCR identifikaciju;
metoda pucanja: nakon uzorkovanja uzorka, dodajte ga u lizat, lizirajte da biste oslobodili genom, uzmite malu količinu liziranog supernatanta i dodajte ga u PCR Master Mix, izvršite PCR identifikaciju.Ovaj pristup pojednostavljuje tijek eksperimentalnog rada, smanjuje vrijeme rada i izbjegava gubitak DNK tijekom koraka pročišćavanja.
7. SOE PCR
Spajanje gena produljenjem preklapanja PCR (SOE PCR) koristi početnice s komplementarnim krajevima kako bi produkti PCR-a formirali lance koji se preklapaju, tako da u naknadnoj reakciji pojačanja, kroz produljenje lanaca koji se preklapaju, različiti izvori tehnike A u kojoj se amplificirani fragmenti preklapaju i spojeni zajedno.Ova tehnologija trenutno ima dva glavna smjera primjene: konstrukcija fuzijskih gena;mutacija usmjerena na mjesto gena.
8. IPCR
Inverzni PCR (IPCR) koristi reverzne komplementarne početnice za umnožavanje DNK fragmenata osim dvaju početnica, te umnožava nepoznate sekvence na obje strane poznatog DNK fragmenta.
IPCR je izvorno dizajniran za određivanje sekvence susjednih nepoznatih regija, a uglavnom se koristi za proučavanje sekvenci promotora gena;onkogene kromosomske preraspodjele, kao što je fuzija gena, translokacija i transpozicija;i integracija virusnog gena, također se sada često koriste. Za mutagenezu usmjerenu na mjesto kopirajte plazmid sa željenom mutacijom.
9. dPCR
Digitalni PCR (dPCR) je tehnika za apsolutnu kvantifikaciju molekula nukleinskih kiselina.
Trenutno postoje tri metode za kvantifikaciju molekula nukleinskih kiselina.Fotometrija se temelji na apsorbanciji molekula nukleinskih kiselina;fluorescentni kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (PCR u stvarnom vremenu) temelji se na vrijednosti Ct, a vrijednost Ct odnosi se na broj ciklusa koji odgovara vrijednosti fluorescencije koja se može otkriti;digitalni PCR je najnovija kvantitativna tehnologija koja se temelji na PCR metodi jedne molekule za brojanje nukleinske kiseline kvantifikacija je apsolutna kvantitativna metoda.
Vrijeme objave: 13. lipnja 2023